光學顯微鏡製片技術 - 中文百科知識

顯微製片法一般包括切片法、整體封片法、塗片法和壓片法4大類。

光學顯微鏡製片技術正文將生物材料 ... 適用於研究活體標本或作組織化學的研究。

乙二醇甲基丙烯酸脂法（ ... 光學顯微鏡製片技術 生物材料製成適於在光學顯微鏡下觀察的薄片的技術。

新鮮的生物材料雖然用簡單的方法做成臨時製片也可觀察，但為了保存以備以後的觀察，常需按一定步驟製成永久製片。

顯微製片法一般包括切片法、整體封片法、塗片法和壓片法4大類。

光學顯微鏡製片技術正文將生物材料製成適於在光學顯微鏡下觀察的薄片的技術。

新鮮的生物材料雖然用簡單的方法做成臨時製片也可觀察，但為了保存以備以後的觀察，常需按一定步驟製成永久製片。

顯微製片首先要儘量保持生物材料的天然狀態，避免膺像、變形和失真,因此須將生物材料做固定處理;製片必須薄而透明，才能在光學顯微鏡下成像，除將材料切成薄片或通過輕壓或其他手段使之分散外，還需採用其他方法使它透明和染色，以便更好地觀察到結構的細節。

需長期保存的製片，還應進行脫水和封固。

顯微製片法一般包括切片法、整體封片法、塗片法和壓片法4大類。

切片法　光學顯微鏡的切片厚度在2～25微米之間，一般動植物材料的切片以厚10微米左右為合適。

切片法根據包埋劑的不同而有所不同。

最常用的是石蠟切片法，它適用於一般生物材料。

棉膠切片法，把生物材料經棉膠包埋後切片。

適用於特別堅硬的材料或特別柔軟而體積大的材料（如完整的大腦）。

冰凍切片法，將生物材料在一定的介質中冰凍固化後切片。

適用於研究活體標本或作組織化學的研究。

乙二醇甲基丙烯酸脂法（簡稱GMA法）,適用於製作1～3微米厚的切片。

石蠟切片法包括固定、包埋、切片、染色、脫水和封固等步驟。

關鍵是把生物材料用石蠟包埋，以石蠟為支持物，把浸在蠟塊中的生物材料切成理想的薄片。

操作過程為：固定→水洗→從低濃度逐級到高濃度酒精脫水→二甲苯透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→二甲苯脫蠟→逐級從高濃度到低濃度酒精處理，最後過渡到水→染色→逐級從低濃度到高濃度酒精脫水→二甲苯透明→樹脂膠封固。

其中的基本步驟在各種製片技術中都是相同的。

固定　用物理的或化學的方法將生物材料迅速殺死、使蛋白質變性和凝固，達到保持細胞的形狀和內部結構的目的。

物理固定法常用冷凍處理或火焰烘烤。

化學固定法，主要是把生物材料迅速浸泡在固定劑中。

固定劑常是含有幾種化合物的混合液，既有強烈凝固蛋白質的化合物，也有非凝固性的化合物，它們對蛋白質起交聯和穩定作用，即所謂“鞣化作用”。

已有的一些比較理想的固定劑,大多以最初設計者命名（表1）。

光學顯微鏡製片技術脫水和透明　固定之後，一般須用水沖洗材料移去多餘的固定液。

為了使材料能為石蠟所浸透，必須將水移去，換成能溶解石蠟的有機溶劑，如二甲苯等。

在製片中常用的脫水劑是乙醇（酒精），將浸在水中的材料依次移入從低濃度到高濃度的乙醇中，最後移到純乙醇中完成脫水。

然後將脫水後的材料移入二甲苯中。

浸透和包埋　在溫箱中用溶化的石蠟取代二甲苯。

使材料逐步為純石蠟所浸透，然後將材料連同熔化的石蠟，倒入小紙盒中，在室溫下或在冷水中使包埋有材料的蠟塊迅速凝固。

浸透和包埋的目的是使材料藉石蠟的支持能被切成薄片。

切片　將包埋好的材料用切片機切成薄片。

切片機有輪轉式切片機（圖1）和滑行式切片機（圖2）兩種。

切片機一般用專門的鋼刀。

光學顯微鏡製片技術光學顯微鏡製片技術包埋材料的蠟塊邊緣要整齊，使被切下的蠟片前後能自然地連線，形成蠟帶，有利於製備連續切片。

切片後，將蠟帶或單個蠟片貼在載玻片上。

染色　先將已貼上有蠟片或蠟帶的載玻片，在染色缸中經二甲苯脫蠟，再經過一系列從高濃度到低濃度的酒精而過渡到水中，即可染色。

生物染料種類繁多，用途各異，可區分為鹼性染料和酸性染料兩大類。

鹼性染料為一種色鹼鹽，可染細胞核，如蘇木精、甲基綠和番紅等。

酸性染料為一種色酸鹽，可染細胞質或核以外的其他成分,如伊紅、橘紅G和固綠等。

鹼性染料和酸性染料混合後稱中性染料，也稱複合染料，如芮氏染色劑和姬姆薩染色劑等。

染色可只用一種染料，但通常採用復染，例如：先染鹼性染料顯示核，再染酸性染料顯示其他結構。

染色的深淺，隨材料的不同和浸染時間的長短而不同，因此要達到合適的程度常需要進行分色，即先過度染色,再使其褪色,當達到合適的程度後即中止。

顯微製片中採用何種染色方法，需根據材料和目的來選擇（表2）。

光學顯微鏡製片技術上述染色方法都是用於經固定而被殺死的材料，在研究生活狀態的生物材料或鑑定細胞的活性時，則用活體染色法。

活體染色需用無毒性的活體染料，並能使特異的細胞結構著色。

例如：中性紅可以顯示活細胞的液泡而詹納斯綠可以顯示線粒體等。

封固　染色之後一般都要用封固劑和蓋玻片把材料封固起來。

只有像血液、細菌等需用油浸鏡觀察的製片才可不加蓋玻片。

封固劑應有較高的折射率和固化後不易碎裂的特點，常用的封固劑是加拿大樹脂。

整體封片法　用於單細胞、微小生物體或分散的器官的整裝製片方法。

此法也需要經過固定、染色、脫水、透明和封固各個步聚。

材料常用洋紅。

代氏蘇木精等單一染色法，但也可復染。

整體封片法中常用冬青油、丁香油一類香精油作為透明劑，以代替二甲苯，這樣可避免標本脆裂，較厚的標本在封固時，要在蓋玻片下墊以適當大小的碎玻璃或玻璃絲以免壓壞。

塗片法　把易於分散的生物標本塗布在載玻片上的製片方法。

此法的永久製片需經固定、染色，脫水等步聚，適用於細菌、血液、花粉母細胞和精子等細小而分散的材料。

血液塗片便是一例。

壓片法　將天然的、易於分散的組織或經過處理後易於分散的組織，如動物的精母細胞、果蠅的唾液腺、植物的花粉母細胞和根尖細胞等放在載玻片上、再加蓋玻片，用力壓碎組織，使細胞或細胞內的結構鋪展成一層的製片方法。

壓片法常用於觀察染色體，通常用醋酸洋紅、地衣紅和石炭酸復紅染色。

參考書目芮菊生等：《組織切片技術》，人民教育出版社，上海，1980。

李正理：《植物製片技術》,科學出版社,北京，1982。

　朱澂：《植物染色體及染色體技術》,科學出版社,北京，1982。

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